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ELISA檢測體系可謂是免疫學(xué)反響應(yīng)用到科研生產(chǎn)中*為廣泛*為活絡(luò)的技術(shù)手段。但是在新老手操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時(shí)就面對許多困難，比如說花板，假陽性，全顯色，悉數(shù)顯色，顯色比空白還低,自己也為此苦惱過很長一段時(shí)間，跟著自己技術(shù)水平得進(jìn)步，或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣，也是游刃有余吧，現(xiàn)在做方陣，做ELISA已是駕輕就熟了，以前檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現(xiàn)在給我十個(gè)八個(gè)的從包被到顯色，一個(gè)作業(yè)日根本搞定。下面就由上?；馍餅槟阏f明一下，做ELISA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié):
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這到你做出的抗體可不可以被其辨認(rèn)，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)厲警告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個(gè)道理。還有有的包被原可能不是蛋白，關(guān)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)咱們要事前對其改造再加以包被，我把辦法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被辦法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。③小分子必須依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。
2、包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)的需要，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附對錯(cuò)特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體外表。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)還要有鞏固的理論外也要實(shí)踐，看一下*終可不可以應(yīng)用到自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了方才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、顯色:顯色體系又許多，咱們一開始做的時(shí)分，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
4、每次做盡量要把陰陽空三個(gè)對照做好，如出現(xiàn)問題也好剖析。
5、關(guān)閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。關(guān)閉就是讓很多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，從而排擠ELISA后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用關(guān)閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度運(yùn)用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但*終選用什么，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)來實(shí)踐。
6、洗刷板：可以說在ELISA操作中，洗刷是*首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達(dá)到別離游離的和結(jié)合的酶符號物的意圖，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì)，在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時(shí)會有必定差錯(cuò)，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡(luò)的ELISA體系但是不小的影響。
7、加抗體標(biāo)本(和二抗):留意該換槍頭時(shí)換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用關(guān)閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太高浪費(fèi)，太低則著色淺。