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其次要考慮的是R&D Systems的免疫測試方法測量的蛋白水平是用一種抗體捕獲的、用第二種抗體測定的，這種測定是在ELISA試劑盒研發時與標準蛋白校正過的。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；

2.次日洗滌3次；

3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；

4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，ELISA試劑盒加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；

5.37℃孵育30-60分鐘，洗滌；

6.’zui后一遍用DDW洗滌。

7.　加底物液顯色：ELISA試劑盒于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

8.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。